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Overview Primer Structure Analysis

Questo programma permette una rapida e completa analisi di alcuni parametri che caratterizzano i primer nelle reazioni di PCR.
Per ogni primer, restituisce, oltre che la temperatura di melting, anche le possibili strutture (hairpin-loop, self e etero dimeri) che i primer formano alla temperatura di annealing (scelta dall'utente). Vengono inoltre analizzate le sequenze dei primer per il contenuto in basi, per la presenza di stretch di basi simili e per la stabilità del 3' del primer.

La formazione di strutture secondarie di DNA e la formazione dei duplex di DNA sono determinati calcolando i parametri termodinamici, entropia ed entalpia, nella reazione di ibridazione, applicando il metodo Nearest Neighbor ed utilizzando i parametri di base di SantaLucia modificati con i parametri suggeriti da Zuker. Le frazione di duplex sono determinate con una appropriata equazione (vedi 'Oligo Melting' ').

In Sintesi:

• a) Temperatura di melting dovrebbe risultare alcuni gradi ( normalmente 4 o 5) maggiore della temperatura di annealing della  reazione di PCR. E' calcolata con le funzioni del programma 'Oligo Melting', presente in questa stessa piattaforma.


• b) Basi contenute nel primer:
  - La sua composizione in basi  (contenuto in GC e AT) deve essere equilibrata
  - Non devono essere presenti stretch di basi uguali o di  dinucleotidi (es. GC o AT)  in quanto,  oltre che destabilizzare  localmente il duplex, potrebbro ibridare in modo aspecifico (nel DNA si trovano spesso regioni con basi o dinucleotidi ripetuti).
  - l’estremità 3’ (le ultime 4 o 5 basi) deve essere ‘equlibrata’ : nel duplex, le estremità al 3' dei due filamenti complementari non devono essere legate molto fortemente (es. con molte GC) in quanto sarebbero favoriti amplificati aspecifici,  non devono neanche essere legate troppo debolmente in quanto renderebbe difficoltoso l’inizio dell’allungamento del primer.


• c) Non devono formare strutture particolari:
  - Non devono poter formare hairpin-loop ‘importanti’. Essendo questa una reazione unimolecolare (il primer si ripiega su se stesso) si può formare anche con poche basi complementari.
  - Non devono poter formare dimeri (self e etero)  ‘importanti’. Questa è una reazione bimolecolare (avviene tra due differenti molecole) e si forma più difficilmente rispetto agli hairpin-loop.
  - Eventuali hairpin-loop e dimeri non devono interessare l’estremità 3’ dei primer in quanto, l’enzima DNA polimerasi potrebbe allungare i primer rendendoli inutilizzabili.

In dettaglio

a) Temperatura di melting:
La temperatura di melting viene calcolata dal  programma oligo-melting (presente in questa stessa piattaforma), determinando l’entalpia e l’entropia di ibridazione con il metodo Nearest Neighbor, usando i parametri proposti da SantaLucia. Esiste il link diretto al programma oligo melting con cui è possibile analizzare i vari aspetti termodinamici di ibridazione.

b) Analisi composizione in basi:
Il programma analizza 4 differenti aspetti, assegnando ad ognuno di essi,  una eventuale penalità se il relativo valore si discosta dall’ottimale.
Ad ogni penalità è associato un peso impostabile dall’utente in ‘advance setting’ (default = 1.0).

-  InBalance bases Penalty (penalità data per il disequilibrio del contenuto in GC e AT):
   penalità = Inbalance_base_weight x 200 x {f(GC)-f(AT)}^2
   dove:
   GC = numero di basi G o C presenti nel primer
   AT = numero di basi A o T presenti nel primer 
   f(GC) = Frazione di GC = GC / lunghezza in basi del primer.
   f(AT) = Frazione di AT = AT / lunghezza in basi del primer.
   Viene assegnata una penalità solo se f(GC) e f(AT) superano 0.6 o sono inferiori a 0.4.

- Stretch penalty (stretch di basi uguali)
   penalità = stretch_weight x [ (n-4) x 10 + (n-2)^2 ];
     dove n è la lunghezza dello stretch
     Viene assegnata una penalità solo se esiste uno stretch di 4 o più basi uguali.

- Stretch bases type penalty (stretch di basi simili (stretch di G o C  e stretch di A o T)
    penalità== GC/AT_stretch_weight x [ (n-3) x 3 + (n-4)^2 ];
    dove n lappresenta la lunghezza dello stretch (in basi)    Viene assegnata una penalità supplementare se uno stretch di AT è localizzato all’estremità 3’ e se l’ultima base è una T.
    Viene assegnata una penalità solo se esiste uno stretch di 5 o più basi simili.

- stability 3' penalty (stabilità termodinamica dell’estremità 3’)
   penalità = = stability_3'_weight x 100 * (8.7+DG)^2,
           dove DG è l’energia libera di ibridazione calcolata con il metodo Nearest Neighbor, a 37°C delle ultime 5 basi al 3’.

c) Strutture (hairpin-loop e dimeri)
Per individuare le possibili strutture viene usato, uno specifico programma di allineamento di corte sequenze ('Short Promix Alignment', presente in questa stessa piattaforma). Successivamente, con gli allineamenti ottenuti, vengono predette le eventuali strutture con l’analisi termodinamica dell’ibridazione usando il metodo 'Nearest Neighbor' all’equilibrio termodinamico.
Vengono mostrate solo le strutture la cui frazione di primer, supera una determinata soglia (definibile dall’utente)

Da notare che il metodo Nearest-Neighbor determina i parametri termodinamici all’equilibrio, mentre una reazione di PCR è un processo dinamico.
Per questo motivo, il programma può visualizza molte strutture, che potrebbero, invece non influenzare la reazione di PCR. L’utente può comunque modificare le soglie sopraddette  in ‘advance setting’ ottenendo così un minor numero di predizioni.

Le strutture vengono predette alla temperatura di annealing (impostabile dall’utente). Se però le strutture interesssano le terminazioni 3’ e  se non si usa una DNA polimerasi tipo 'hot start',  allora il programma analizza anche eventuali strutture ad una temperatura più bassa, selezionabile dall'utente (default 37°C) per predire eventuali allungamenti di primer anche alle basse temperature dove già esiste l’attività della DNA polimerasi  (in questo caso, nel calcolo, viene utilizzata una efficienza di 10 volte inferiore a quella normale)

L'utilizzo una DNA polimerasi 'proofreading' cioè con attività esonucleasica 5'-3', aumenta il pericolo di allungamento dei primer al 3' . Questo tipo di enzima è in grado di digerire le basi non complementari al 3' e poi iniziare la sintesi corretta del nuovo filamento.
Selezionando questa opzione , il programma valuterà  eventuali allungameti del 3’ dei primer anche se le strutture non coinvolgono completamete le terminazioni al 3'