Overview Amplicone Analysis
Analisi del prodotto di una reazione di PCR
- 1) Analisi del contenuto in basi e caratteristiche termodinamiche dei primer (mediante i programmi 'Oligo Melting' 'Primer Structure Analysis', presenti in questa stessa piattaforma): predice la temperatura di melting dei primer, analizza la loro composizione e la loro ripetizione di basi e predice le possibili strutture (dimeri ed hairpin-loop).
- 2) Predizione della frazione di templato e dell'amplicone che si ibrida ai primer, alla temperatura di annealing (con eventuale presenza di mismatch;
- 3) Predizione di hairpin-loop che coinvolgono le regioni di ibridazione dei primer e che potrebbero formare un impedimento sterico ai primer stessi. (Nota: Nei primi cicli è coinvolta la sequenza a monte e a valle della regione del primer, nei successivi invece è coinvolta solo la regione a valle)
- 4) Predizione di hairpin-loop, nella parte interna dell'amplicone, alla temperatura di estensione, che potrebbero creare un ostacolo all'attività polimerasica della DNA polimerasi.
- 4) Conclusioni ed equazione della reazione di PCR.
Il programma con maggior dettaglio:
Per ottenere una ‘efficiente’ reazione di PCR, è necessario che ad ogni ciclo, tutti i filamenti ‘stampo’ siano ibridati ai rispettivi primer. In questo caso, il prodotto di PCR raddoppia ad ogni ciclo:
Quantità_Prodotto(ciclo) = [n.molecole iniziali] x 2^ciclo.
Questa progressione esponenziale è valida però, solo nei primi cicli, intervengono poi inibizioni, saturazioni che impediscono la sintesi di nuovi filamenti.
E' buona norma impostare la temperatura di annealing della reazione, 4 o 5 °C più bassa della temperatura di melting. Ricordo che la temperatura di melting è la temperatura alla quale la metà dei filamenti 'stampo' sono ibridati ai primer.
Si consiglia di consultare il programma Oligo Melting (presente in questa stessa piattaforma) per osservare in particolare la curva di ibridazione in funzione della temperatura .
(Nei risultati, esiste anche un link diretto a Oligo Melting).
- 1) Analisi del contenuto in basi e le caratteristiche termodinamiche dei primer
Per gli approfondimenti, si rimanda al programma Primer Structure Analysis' presente in questa stessa piattaforma.
- 2) Predizione della frazione del DNA stampo (DNA iniziale o amplicone) che forma i duplex con i primer, (alla temperatura di annealing).
'Amplicon Analysis' utilizza il programma 'Oligo Melting' per determinare la frazione di filamenti stampo ibridata ai primer, alla temperatura di annealing.
Quest'ultimo programma, adottando il metodo Nearest Neighbor,
stima i parametri termodinamici di ibridazione (entropia ed entalpia), all'equilibrio termodinamico e, da questi parametri, ricava la frazione di templato ibridata ai primer.
L'estensione del primer, però, non avviene solamente alla temperatura di estensione della PCR,
in quanto, l’enzima DNA polimerasi, ha una attività polimerasica anche a temperature inferiori a quelle di estensione.
In particolare, già nella fase di annealing, i primer possono essere 'allungati'. La maggior dimensione del duplex (primer allungato/templato),
rende più stabile l'ibrido, spostando l’equilibrio della reazione di ibridazione verso la formazione del duplex.
Per questo motivo, il programma, adotta il parametro Temperature factor (impostabile dall'utente in Advance setting nella form iniziale) per umentare la stima di templato ibridato.
In particolare : le frazione di filamenti stampo ibridati ai primer, vengono determinate, tenendo costanti i valori entropici ed entalpici ottenuti applicando la temperatura di annealing, calcolandala però ad una temperatura inferiore, data dal relativo parametro 'Temperature Factor' .
(Si ottiene un valore maggiore rispetto a quello teorico)
Nei primi cicli, sono i filamenti del DNA templato iniziale a fare da stampo, successivamente invece, avranno questo compito, i nuovi filamenti sintetizzati.
Nei primi cicli, il DNA templato potrebbe non essere perfettamente complementare ai primer (presenza di mismatch).Questo programma, usando Oligo Melting, determina la frazione di templato che si ibrida ai primer, alla temperatura di annealing, anche in presenza di eventuali mismarch.
I filamenti dell'amplicone, che costituiscono lo stampo nei cicli successivi, risultano essere invece, sempre perfettamente complementari ai primer, avendo incorporato le sequenze dei primer stessi.
La frazione di filamenti stampo, ibridati ai primer, dipenderà, quindi, solamente dalla caratteristica sequenza dei primer.
(Nota: è possibile verdere i grafici di formazione del duplex in funzione della temperatura di due sequenze con e senza mismatch richiamando il programma Oligo Melting,
presente in questa stessa pattaforma).
3) Predizione di eventuali hairpin-loop che coinvolgono le regioni di ibridazione dei primer alla temperatura di annealing
Queste strutture potrebbero creare degli impedimento sterici alla ibridazione dei primer con il filamento stampo.
Nei primi cicli, essendo il DNA templato a fare da stampo, potranno formarsi hairpin-loop sia con la sequenza a valle che con quella a monte
della regione di ibridazione del primer. Eventuali impedimenti, influenzeranno solo la parte proporzionale della reazione di PCR.
Nei cicli successivi, esseno i filamenti neo-sintetizzati (amplicone) a fare da stampo, potranno formarsi hairpin-loop solo con le sequenze a valle.
Questi eventuali impedimenti influenzeranno la parte esponenziale della reazione.
Per ricercare le regioni complementari, che possono generare gli eventuali hairpin-loop, il programma allinea la sequenza del templato contro l'inversa di se stessa,
utilizzando il programma di allineameno Blast (parametri W=6 , q=-3, r=2, G=2, E=2, e=5000).
Nell'allineamento, non viene utilizzata l'intera sequenza dei filamenti stampo, ma solo la sequenze che si trova in un intorno della regione di appaiamento dei primer.
Tale intorno è definito dal parametro 'Lateral extention', (default=300, variabile dall'utente).
(Nota: maggiore è la distanza tra due parti complementari, più instabile è l'eventuale formazione di hairpin-loop. Il valore 'Lateral extention' di default è solitamente sufficiente per predire correttamente gli eventuali hairpin-loop, è quindi sconsigliabile aumentare tale parametro in quanto aumentarebbe il tempo di esecuzione del programma, senza ottenere apprezzabili nuove predizioni).
Gli allineamenti ottenuti, compatibili con la formazione di dette strutture, che coinvolgono la regione di appaiamento del primer,
vengono analizzati con i programmi di Oligo Melting per determinare la frazione di filamenti che formano tali strutture, alla temperatura di annealing, all'equilibrio termodinamico.
Tale frazione ha solo valore indicativo, in quanto la reazione è dinamica, i primer possono competere per la stessa regione,
e, se il primer viene allungato dalla DNA polimerasi, impedisce il ripiegamento del filamento stampo.
Quindi, tale frazione ottenuta all'equilibrio, dovrà essere corretta opportunamente.
Attualmente non esistono studi, che permettono di prevedere tali situazioni,
il programma utilizza i parametri 'Temperature Factor' , impostabili dall'utente in 'Advance Setting' nella form iniziale,
per modificare le temperature a cui vengono calcolate le frazioni di duplex ottenute all'equilibrio termodinamico.
Eventuali nuovi valori, o nuovi algoritmi più precisi, potranno essere nel futuro adottati grazie anche ai suggerimenti e all'esperienza di chi vorrà collaborare.
In particolare : gli hairpin-loop, tenendo costati i valori entropici ed entalpici calcolati alla temperatura di reazione, vengono determinati aumentando la temperatura del valore contenuto nel relativo 'Temperature Factor' . (Si ottiene un valore minore rispetto a quello teorico)
4) Eventuali Hairpin-loop interni all’amplicone, alla temperatura di estensione della PCR possono impedire l’avanzamento della DNA polimerasi. Ha effetto durante tutti i cicli di PCR, quindi l’inibizione agisce nella fase esponenziale della PCR.
Come nel caso precedene, le eventuali strutture sono predette allineando le sequenze dei filamenti stampo contro la sequenza inversa di se stessa,
con il programma di allineamento Blast (parametri W=6 , q=-3, r=2, G=2, E=2, e=1000).
Gli allineamenti ottenuti, compatibili con la formazione di dette strutture,
vengono analizzati con i programmi di Oligo Melting per determinare la frazione di filamenti che formano tali strutture, alla temperatura di estensione, all'equilibrio termodinamico.
Anche in questo caso bisogna considerare la dinamicità della reazione
(lo 'scioglimento' temporaneo dell'eventuale struttura, permette alla DNA polimearasi di allungare il nuovo filamento, impedendo
al filamento stampo di ripiegarsi nuovamente).
Quindi, tale frazione ottenuta all'equilibrio, dovrà essere corretta opportunamente.
Anche in questo caso,
il programma usa i parametri 'Temperature Factor' , impostabili dall'utente in 'Advance Setting' nella form iniziale,
per modificare le temperature a cui vengono calcolate le formazione di dette strutture.
-In particolare, tenendo costati i valori entropici ed entalpici ottenuti alla temperatura di estensione, viene dererminata la frazione di filamento stampo coinvolta negli hairpin-loop ad una temperatura maggiorata dal relativo valore impostato in 'Temperature Factor'. (Si ottiene un valore minore rispetto a quello teorico)
5) Conclusioni ed equazione della reazione di PCR
Finchè non intervengono particolari inibizioni e/o saturazioni che impediscono la sintesi di nuovi filamenti,
il prodotto della reazione di PCR in funzione del ciclo, può essere espresso dall'equazione
Quantità_Prodotto(ciclo) = (Eff.iniziale x [n.molecole iniziali]) x Eff.esp^ciclo
- n.molecole iniziali : quantità di DNA stampo iniziale.
- Eff.iniziale rappresenta l'efficienza nel copiare i primi filamenti di DNA templato. Questa efficienza può dipendere dalle caratteristiche del primer, dall'effetto dovuto da eventuali mismatch, dall'effetto di impedimenti sterici all'acceso dei primer, dall'impedimento all'avanzamento della DNA polimerasi. Questo efficienza ha effetto solo nella prima parte della reazione (effetto lineare nell'equazione), è come se diminuisse la quantità di filamento iniziale.
Il programma calcola: Eff.iniziale = frazione DNA iniziale ibridata ai primer x frazione di DNA iniziale libera da hairpin-loop nelle regioni dei primer x frazione di DNA iniziale libera da hairpin-loop nella regione amplificata.
- Eff.esp rappresenta l'efficienza della reazione nel ri-copiare i filamenti neo sintetizzati. Questa efficienza può dipendere dalle caratteristiche del primer (match perfetto), dall'effetto di impedimenti sterici all'acceso dei primer (è interessata solo la parte a valle del filamento stampo), dall'impedimento all'avanzamento della DNA polimerasi (come il caso preecedente). Questa efficienza ha effetto nella parte esponenziale della reazione e può avere effetti drammatici. L'efficienza ottimale dovrebbe tendere al valore 2.0.
Il programma calcola: Eff.esp = 1 +( frazione filamenti dell'amplicone ibridata ai primer x frazione di filamenti dell'amplicone libera da hairpin-loop nelle regioni dei primer x frazione di filamenti dell'amplicone libera da hairpin-loop nella regione amplificata)