Melting DNA-Hybrid Project
Amplicon Analysis (Release 2011_01)
Thermodynamics Analysis primer/template/amplicon structure)
by Ivano Zara


This application allows to determine the 'goodness' of a PCR product, analyzing the primers in relation to the template sequence..
It analyzes primers with 'Primer Structure Analysis' (see melting-program) and predicts the formation of any hairpin-loops of the template, which involve the region of hybridization of the primers, which can then create steric bulk and prevent the access of primers into the hybridization region.
The eventual hairpin-loops, inside the amplified sequence, that can obstruct the progression of the DNA polymerase are also analyzed.
Overview (only in the Italian language)

Amplicon Analysis(Beta TEST)
Primer
Primer for (5'-->3')

      
Primer REV
primer rev:
5'-->3'
As strand ' + '
As complementar of strand ' + '
Primer location (see note)

Choice the Best Primer alignment
     OR     
Use square brackets into sequence
(at the moment not enabled)
     OR     

choice primer location
3'primer FOR:
3' primer REV:
Template (choice only one option)
Template Sequence (strand '+')
OR Select Local File template

DNA in circular form
Solution and PCR parameters
[Na+] mM       [Mg++] mM       [dNTPs] mM       [primer] mM    

Annealing Temperature °C            Extention Temperature °C         
Polymerase proofreading (exonucleasic 3' activity 3'-5' (proofreading)) (under construction)
 
           
 
 

Note: There are three ways to locate primers on the template
1) Choice the Best Primer alignment: the program automatically chooses the best alignment

2) location 3' primer FOR and REV: Input the 3 'ends of the two primers

3) Use square brackets into sequence: Inserting square brackets that delimit the sequence to be amplified


Advance Setting
.
Cutoff_f_min_eff_start_PCR %
Cutoff_f_min_oligo_template_hairpin %
Cutoff_f_min_internal_hairpin %
Lateral Extention

Temperature factor to modify;:
template in duplex (0-10)
template in hairpin-loop in primer region (0-20)
template in hairpin-loop in internal amplicon (0-20)
Note: These values have been inserted to also consider the dynamism of the PCR reaction.
They modify the fractions of hybrid primer/template or the hybrid fractions of hairpin-loops
which are calculated with thermodynamic equilibrium methods.

Per la predizione delle frazioni di duplex o le frazioni di eventuali strutture secondarie di DNA (dimeri o hairpin-loop), vengono utilizzati parametri ed equazioni termodinamiche, che non considerano la dinamicità delle reazioni (competizioni ed attività enzimatica). Per modificare i valori ottenuti con tali equazioni, per tener conto ddella dinamicità, il programma utilizza particolari parametri (Temperature factor) , impostabili in 'Advance Setting', nella form iniziale.
Non esistendo studi specifici, tali parametri vengono impostati per default dal programma, con dei valori che rappresentano un primo tentativo per ottenere una 'significativa' predizione. Tali parametri, sicuramente dovranno essere calibrati nel futuro. .

Chi utilizza i nostri programmi, per analizzare e/o progettare reazioni di PCR, può contribuire al miglioramento di dette predizioni, inviando all'autore (ivano.zara @ cribi.unipd.it) i risultati ottenuti nei propri esperimenti di real-time PCR.
Chi invierà le proprie osservazioni, se lo vorrà, sarà citato nel sito.